File-filenya rismaka.wordpress.com

Icon

Just another WordPress.com weblog

ISOLASI DAN AMOBILISASI SEL/ENZIM BETA GALAKTOSIDASE

PENDAHULUAN

Penggunaan enzim dalam yang telah diisolasi sebagai molekul bebas, yakni terlarut dalam air, dalam analisis kurang menguntungkan, karena enzim hanya dapat digunakan untuk satu kali reaksi dan enzim tersebut sulit dipisahkan dari produk dan substrat. Agar enzim tersebut dapat dipakai berulang dan dapat dipisahkan maka dapat digunakan suatu metode yaitu teknik imobilisasi enzim.

Imobilisasi enzim dapat dianggap sebagai metode yang merubah enzim dari bentuk larut dalam air “bergerak” menjadi keadaan “tak begerak” yang tidak larut Imobilisasi dmencegah difusi enzim ke dalam campuran reaksi dan mempermudah memperoleh kembali enzim tersebut dari aliran produk dengan teknik pemisahan padat/cair yang sederhana. Imobilisasi dapat dilakukan dengan berbagai cara, antara lain melalui pengikatan kimiawi molekul enzim pada bahan pendukung, pengikatan silang intermolekuler sesama enzim, atau dengan cara menjebak enzim di dalam gel atau membran polimer (Palmer, 1991).

Beberapa keuntungan penggunaan enzim amobil daripada enzim bebas antara lain meningkatkan stabilitas enzim, mengurangi jumlah enzim yang digunakan, mempermudah untuk pemisahan dan enzim untuk digunakan kembali, kemudahan untuk penggunaan selanjutnya, mempermudah untuk memisahkan hasil, dan pada beberapa kasus dapat meningkatkan aktivitas enzim (Nam Sung Wang, Jurnal “Enzyme Immobilization By Gel Entrapment”).

Teknik imobilisasi yang paling baik untuk dipilih adalah yang memenuhi kriteria utama yakni tidak terjadi perubahan konformasi enzim dan tidak mengganggu gugus fungsi di pusat aktif enzim sehingga enzim tetap dapat berfungsi. Metode penjebakan enzim lebih banyak digunakan karena enzim ada dalam keadaan bebas dan tidak terikat pada bahan pendukung sehinga secara relatif fungsi katalitik dan struktur alami molekul enzim tidak mengalami gangguan goncangan (Kierstan & Coughlan 1985, Wirahadikusumah 1988).

Escherichia coli digunakan sebagai strain untuk percobaan karena memiliki sekitar 2000 jenis enzim dan beberapa strain yang telah dilaporkan mampu menghasilkan enzim ?-galaktosidase yang akan mengkatalisis hidrolisis ikatan ?-galaktosida. Selain itu, E.coli mudah untuk diperoleh, dikembangbiakkan dan mudah ditangani. Sebab pada suhu kamar E.coli dapat ditumbuhkan, dan canderung resisten terhadap beberapa bakteri patogen.

Uji aktivitas dilakukan dengan menggunakan ONPG sebagai sustrat. Pada keadaan alkalis, hasil penguraian ONPG oleh enzim ?-galaktosidase akan membentuk warna sehingga dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang 420 nm.

TUJUAN

Percobaan bertujuan untuk mengetahui aktivitas sel Escherichia coli yang teramobilisasi dalam menghidrolisis ikatan ?-galaktosida, dan melakukan amobilisasi sel dengan menggunakan poliakrilamid sebagai bahan pendukung.

ALAT DAN BAHAN

Bahan-bahan yang digunakan antara lain strain E.coli, medium kultur bakteri dengan kandungan: NaCl 0,2%, laktosa 0,6%, MSG 0,1%, ekstrak yeast 0,1%, KH2PO4 0,15%, Na2HPO4 1,35%, MgSO­4.7H2O 0,02%, CaCl2 0,001, dan

FeSO­4.7H2O 0,00005%; akrilamid; NN-metilbisakrilamid; larutan TEMED pekat; buffer fosfat; K2S2O8 2,5%; dan Na2CO3 2 M.
Alat-alat yang digunakan antara lain erlenmeyer, tabung reaksi, jarum ose, shaker inkubator, tabung sentrifuse, sentrifuse Bagman JA-20, otoklaf, gelas piala, batang pengaduk, spektrofotometer, kuvet, oven, vortex, dan pisau.

PROSEDUR PERCOBAAN

Medium dari bakteri E. coli yang digunakan untuk produksi ?-galaktosa disterilkan dengan autoklaf selama 30 menit. E. coli dipindahkan dari agar kering ke dalam medium fermentasi yang telah dingin dengan ose, medium kemudian dikocok selama 18 jam pada temperature kamar. Jumlah sel diukur berdasarkan nilai OD pada 620 nm. Sejumlah inokulum dipindahkan kedalam 300 ml medium fermentasi yang sudah steril. Selanjutnya medium fermentasi dikovok selama 24 jam paada suhu kamar. Pasta sel diperoleh dengan cara sentrifusi pada 2-40C dengan kecepatan 4500 RPM selama 30 menit. Pasta sel dicuci dengan aquades dingin dan disentrifuse kembali pada 4500 RPM selama 15 menit.

Akrilamid sebanyak 750 mg dicampurkan dengan 40 mg NN-metilenbisakrilamid dalam gelas kimia yang telah berisi 3.0 ml buffer fosfat 0.08 M pH 7.7. Pada larutan tersebut ditambahkan 1.0 g pasta sel E. coli, aduk hingga merata. Ke dalam campuran tambahkan 0.5 ml larutan TEMED 5% dan 0.5 ml larutan persulfat 1%. Setiap kali penambahan bahan campuran selalu diaduk. Reaksi polimerisasi dibiarkan berlangsung pada suhu kamar selama 10 menit. Gel yang terbentuk dipotong-potong dengan ukuran 2x2x2 mm3 dan kemudian dicuci menggunakan buffernya. Sel amobil yang telah dicuci dapat langsung dipakai atau disimpan dalam temperaur 5 oC.

Untuk menguji aktivitas amobilisasi terhadap aktivitas enzim maka dilakukan penentuan aktivitas enzim terhadap sel amobil dan sel bebas dalam kondisi yang sama. Disediakan dua buah labu Erlenmeyer kecil yang bersih dan tertutup, masing-masing diisi dengan 15 ml larutan substrat dalam buffer fosfat 0.08 M pH 7.7. pada labu pertama diisi dengan 1.0 gram E.coli bebas dan labu kedua dengan 1.0 gram E.coli amobil. Kedua Erlenmeyer ditutup rapat dan ditempatkan pada shaker incubator 37 oC selama 5-10 menit. Penghentian reaksi dilakukan dengan mempipet 1ml larutan fermentasi dan memasukkannya ke dalam tabung reaksi yang berisi 5 ml larutan Na2CO3 2M, kemudian diukur absorbansinya pada 420 nm.

Cawan porselin yang bersih dipanaskan pada 110 oC sampai didapat berat yang konstan. Sel mikroba hasil isolasi dimasukkan kemudian cawan beserta isinya ditimbang lalu dikeringkan pada 110 oC sebelum ditimbang lagi sampai didapat berat yang konstan

Hidrolisis ikatan ?-galaktosa pada OPNG dilakukan dalam kolom dengan ukuran 1.5×16 cm, bagian tengah kolom ditutup dengan glasswol yang dilapisi kertas saring. Kemudian sel yang telah amobil dimasukkan kedalam kolom dan dielusi menggunakan substratnya dengan mengatur kecepatan alirnya. Fraksi yang keluar ditampung dalam tabung-tabung reaksi yang sudah siap pakai sebanyak 6 ml, kemudian diukur absorbansinya apda panjang gelombang 420 nm.

DATA DAN HASIL PENGAMATAN

Ulangan Absorban
1 1.1805
2 1.1739
X=1.1772
Perhitungan OD
? yang ditambahkan= 325×0.01
A
= 325×0.01
1.1772
=2.7608
Jumlah V = 2×2.7608 = 5.5216 ? 5.6 ml

Perhitungan bobot pasta perolehan
Bobot botol = 15.69 g
Bobot botol + pasta = 16.54 g
Bobot pasta = 16.54 – 15.69 = 0.85 g
Bobot pasta gabungan = 1.0897 g

Penggunaan pasta sel
Bobot pasta sel untuk pembuatan sel amobil = 0.2800 g
Bobot pasta sel untuk penghitungan bobot kering sel = 0.1018 g
Bobot arloji = 6.8468 g
Bobot kering sel + arloji = 6.8668 g
Bobot kering sel = 0.0200 g
Bobot pasta sel untuk pembuatan sel bebas = 0.7078 g

No Volume nitrofenol (mL) Konsentrasi
nitrofenol (mM) Volume buffer fosfat (mL) Volume NaHCO3 (mL)
Transmitan
(%T)
Absorbansi
-log(%T/100)
Blanko 0.00 0.0000 1.00 5.00 100.0 0.0000
1 0.20 0.0667 0.80 5.00 12.7 0.8962
2 0.40 0.1333 0.60 5.00 2.9 1.5376
3 0.60 0.2000 0.40 5.00 1.1 1.9586
4 0.80 0.2667 0.20 5.00 0.8 2.0969
5 1.00 0.3333 0.00 5.00 0.7 2.1549

Waktu inkubasi
(menit) Transmitan
(%T) Absorbansi
-log (%T/100) Konsentrasi
(mM) Aktivitas
(?mol/mL.menit) Aktivitas spesifik
(?mol/menit.mg)
0 40.5 0.3925 0.0014 0.0000 0.0000
5 2.6 1.5850 0.1894 1.6339 0.0817
10 2.2 1.6576 0.2009 0.8663 0.0433
15 2.0 1.6990 0.2074 0.5963 0.0298

Waktu inkubasi
(menit) Transmitan
(%T) Absorbansi
-log (%T/100) Konsentrasi
(mM) Aktivitas
(?mol/mL.menit) Aktivitas spesifik
(?mol/menit.mg)
0 41.7 0.3799 -0.0006 0.0000 0.0000
5 15.6 0.8069 0.0667 0.5756 0.0288
10 13.9 0.8570 0.0746 0.3219 0.0161
15 12.7 0.8962 0.0808 0.2324 0.0116
Contoh perhitungan absorbansi untuk Escherichia coli bebas, menit ke 5:

E. coli bebas E. coli amobil
Aktivitas spesifik (unit/mg) Aktivitas spesifik (%) Aktivitas spesifik (unit/mg) Aktivitas spesifik (%)
5 0.0817 100.00 0.0288 35.25
10 0.0433 100.00 0.0161 37.18
15 0.0298 100.00 0.0116 38.93

PEMBAHASAN

Bakteri Escherichia coli menghasilkan berbagai macam enzim salah satunya yaitu ?-galaktosidase. ?-galaktosidase merupakan substrat chromogenic artifisial. Suhu dan pH optimum ?-galaktosidase yaitu 42°C dan 5,8. Dalam percobaan ?-galaktosidase diperoleh dari kultur sel E.coli pada media fermentasi. Jumlah sel yang perlu ditambahkan ke dalam media fermentasi ditentukan berdasarkan nilai Optical Dencity (OD) pada 620nm. Dari percobaan diperoleh hasil sebesar 2,7608mL untuk jumlah OD yang ditambahkan, tetapi dalam perlakuannya ditambahkan 5,6mL inokulum bakteri agar diperoleh pasta sel yang lebih banyak. Pasta sel total yang diperoleh yaitu sebesar 0.85 g dan jumlah pasta gabungan dari keempat kelompok sebesar1.0897 g.

Pembentukan gel dipercepat dengan mereaksikan kaliun persulfat dan TEMED ke dalam campuran. Pasta sel yang diambil untuk pembuatan sel amobil seberat 0,2800g. Campuran dicetak dalam gelas piala kecil dan disimpan pada suhu 5°C karena panas yang tinggi dapat menyebabkan enzim terdenaturasi sehingga menyebabkan inaktivasi enzim dan menghambat proses isolasi enzim. Metode penjebakan enzim dalam gel sangat lunak dan tidak ada modifikasi kimia atas enzim sehingga tidak akan merusak aktivitas enzim. Enzim yang terjebak dalam volume gel tersebut tetap berada dalam bentuk aslinya tanpa resiko adanya penutupan bagian aktif, gugus atau molekul enzim oleh ikatan kimia.
Penerapan teknik amobilisasi sel untuk menghidrolisis ikatan tersebut memberikan beberapa keuntungan antara lain, diperoleh stabilitas enzim yang lebih tinggi, enzim dapat digunakan berulang kali, tidak diperlukan isolasi dan pemurnian enzim, proses kontinu dapat dikerjakan lebih sederhana dan praktis, serta pengendalian reaksi enzimatis dapat diatur lebih baik

Pada percobaan kedua jenis enzim ?- galaktosidase sel amobil dan bebas mendapatkan perlakuan yang sama yaitu enzim diukur dalam kondisi yang sama yaitu pada suhu ruang (37 °C) dan pada pH 7,7 yang merupakan pH optimum dari buffer fosfat. Kondisi ini bukan merupakan kondisi optimum dari ?- galaktosidase, suhu dan pH optimum ?-galaktosidase yaitu 42°C dan 5,8. Pengujian aktivitas ?- galaktosidase menggunakan substrat ONPG 2,5mM. Dalam keadaan alkalis ?- galaktosidase menguraikan ONPG menjadi senyawa berwarna kuning yaitu nitrofenol. Penghentian reaksi dilakukan dengan cara menambahkan Na2CO3. Pengukuran dilakukan dengan metode spektrofotometri pada 420nm. Dari perobaan ini diharapkan akan memberikan hasil yang tepat pada jumlah sampel yang banyak pengukuran aktivitas assay enzim berdasarkan pada perubahan intensitas cahaya yang diabsorbsi oleh larutan yang telah ditambah reagen. Intensitas warna kuning setara dengan banyaknya aktivitas enzim tersebut.
Untuk dapat menentukan konsentrasi nitrofenol hasil degradasi ONPG oleh enzim, diperlukan satu kurva standar nitrofenol. Dari hasil percobaan didapatkan persamaan kurva standar yaitu Y= 6,3423X + 0,3837 dengan R2 sebesar 87,13%. Berdasarkan kurva persamaan diatas maka dapat ditentukan konsentrasi konsentrasi produk nitrofenol dan aktivitas spesifik enzim baik yang amobil maupun yang bebas. Terlihat bahwa imobilisasi ada enzim mengakibatkan penurunan konsentrasi produk dan aktivitas spesifik enzim tersebut berdasarkan hasil yang diperoleh dari tabel 5 dan

KESIMPULAN

Berdasarkan percobaan daat disimpulkan bahwa imobilisasi pada enzim mengakibatkan penurunan aktivitas spesifik dan konsentrari produk yang dihasilkan. Dari hasil percobaan didapatkan persamaan kurva standar yaitu Y= 6,3423X + 0,3837 dengan R2 sebesar 87,13%. percobaan dilakukan pada suhu ruang (37 °C) dan pH 7,7 yang merupakan pH optimum dari buffer fosfat. Pengukuran dilakukan dengan metode spektrofotometri pada 420nm. Intensitas warna kuning yang dihailkan setara dengan banyaknya aktivitas enzim tersebut.

DAFTAR PUSTAKA

Jusuf, M. 2001. Genetika I. Sagung Seto, Jakarta.
Albert, Brush. 1994. Biologi Molekular Sel Edisi ke-2. Gramedia, Jakarta.
Murray, Robert K. 2000. Biokimia. Terjemahan Andry Hartono. Buku Kedokteran. EGC, Jakarta.

File Resource rismaka | eldiosa | rismaka | rismaka | IS

Filed under: Uncategorized

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s

%d bloggers like this: